Kromatografi Kolom

Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif.

Peralatan Kromatografi Kolom

Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5 cm – 1 m. Pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk menghindari hilangnya fasa diam.

Fasa gerak

Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen yang digunakan dapat dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.

Fasa diam

Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan.

Metode

Dua metode utama yang digunakan yaitu metode kering dan metode basah:

Metode kering

Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.

Metode basah

Pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar hati-hati supaya tidak ada gelumbung udara. Larutan senyawa organik dipipet di bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.

Cara Kerja Kromatografi Kolom

Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi.

Seluruh proses kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar berikut: